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Tres sistemas de expresión de proteína recombinante

Tiempo de actualizacion : 2021-02-03

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Tres sistemas de expresión de proteína recombinante
La expresión recombinante de proteína se refiere a la clonación del gen extraño en un vector de expresión que contiene un promotor específico y permite que se sobreexprese en E. coli bajo la inducción de IPTG. Diferentes proteínas son adecuadas para diferentes sistemas de expresión, que incluyen principalmente vectores de expresión, cepas hospedadoras y condiciones de inducción.

Elección del vector de expresión:


La elección del vector de expresión de la proteína de fusión está restringida por muchos factores. En primer lugar, debe haber un sitio de clonación múltiple adecuado en el vector. En segundo lugar, es necesario seleccionar la etiqueta de fusión adecuada de acuerdo con las condiciones de purificación de proteínas posteriores.


Las etiquetas de fusión más utilizadas son His.Tag, GST.Tag, Nus.Tag y Trx.Tag. Entre ellos, la etiqueta His es relativamente pequeña y no tiene un impacto evidente en las propiedades estructurales de la proteína.

Después de la purificación por cromatografía de afinidad, no se requiere la eliminación de la etiqueta; sin embargo, una etiqueta un poco más grande como GST debe eliminarse con una enzima específica en el proceso posterior. En muchas aplicaciones prácticas, a menudo es deseable expresar una proteína activa soluble.

La solubilidad de una proteína diana específica depende de muchos factores, incluido el vector. El portador con GST.Tag puede aumentar la solubilidad de la proteína de fusión.


Selección de la cepa huésped:


El estado de expresión de la misma proteína en diferentes hospedadores puede ser diferente. Los hosts de la serie BL21 son actualmente los más utilizados. La cepa huésped Rosetta derivada de BL21 puede mejorar la expresión de proteínas eucariotas con codones raros de E. coli.

Esta cepa complementa los ARNt de los codones AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA a través de un plásmido compatible resistente al cloranfenicol. De esta manera, la cepa Rosetta proporciona una traducción "universal", evitando así las restricciones de expresión debido a la frecuencia de uso del codón de E. coli. El anfitrión BL21 (DE3) facilita la formación de cuerpos de inclusión.


Condiciones de inducción:


Los cambios en las condiciones de inducción también afectan la expresión de proteínas. En general, las proteínas solubles se necesitan principalmente en aplicaciones prácticas, lo que requiere encontrar la temperatura de inducción más adecuada.

La proporción de proteína soluble sintetizada por la mayoría de las proteínas en condiciones de inducción durante la noche a baja temperatura (15 ~ 25 ℃) será relativamente grande.


Además, la concentración del inductor también tiene un efecto sobre el estado de expresión de la proteína, y una concentración baja del inductor es beneficiosa para la expresión de la proteína soluble. Una temperatura más alta puede aumentar la velocidad de síntesis de proteínas, la velocidad de plegado de intermedios para formar agregados y la fuerza de interacción hidrófoba.


Es probable que la proteína expresada exista en forma de cuerpos de inclusión. La mayor concentración de inductor (IPTG 0,8-10 mM) también puede promover la formación de cuerpos de inclusión en las bacterias. Para los recombinantes pET con promotores T7 ordinarios, se puede inducir completamente IPTG con una concentración final de 0,5 mM, mientras que los vectores con promotores T7lac requieren IPTG con una concentración final de 0,8 mM para ser completamente inducidos.


En algunas bacterias hospedadoras DE3, el nivel de expresión de proteínas se puede cambiar ajustando la concentración de IPTG. Generalmente, se realiza una pequeña cantidad de inducción de prueba antes de la expresión a gran escala de la proteína para determinar la concentración óptima de IPTG y la temperatura de inducción óptima para hacer que la proteína objetivo alcance la mejor actividad y solubilidad.

Para operaciones más específicas de inducción, consulte Generalbiosystems, la última actualización del artículo de la compañía de expresión de proteínas recombinantes.