Estrategias para la expresión de proteínas de E. coli de alta eficiencia

(1) La elección del vector de expresión.

La elección del promotor del vector de expresión es muy importante. La estructura del promotor afecta su afinidad con la ARN polimerasa, lo que afecta el nivel de expresión génica. El promotor ideal debe satisfacer:

(2) Optimización de codones.

Cuando los genes que contienen una gran cantidad de codones raros se expresan en E. coli, la falta de ciertos ARNt en E. coli reducirá la eficiencia y estabilidad de la traducción del ARNm e incluso provocará errores de traducción o una terminación prematura. La modificación del codón del gen diana puede mejorar la estabilidad y la eficiencia de traducción del ARNm.

(3) Proteínas de fusión y chaperonas moleculares.

Las proteínas de fusión no solo se pueden usar como etiquetas de afinidad para facilitar las operaciones de purificación posteriores, sino que también las proteínas de fusión macromolecular pueden aumentar la expresión soluble de proteínas, como la glutatión-S transferasa (GST), la proteína SUMO, la proteína de unión a maltosa (MBP), que es altamente hidrofílico, ayuda a mejorar la solubilidad y estabilidad de la proteína diana; La coexpresión de chaperonas moleculares puede promover el plegamiento y procesamiento postraduccionales de proteínas recombinantes y mejorar la solubilidad y estabilidad de la proteína.

Los sistemas GroEL y GroES se utilizan comúnmente en el sistema de E. coli; proteína de choque térmico DnaK, DnaJ y sistema ternario GrpE; Familia Dsb (enlace disulfuro reductasa e isomerasa), que puede promover la formación de enlaces disulfuro.

(4) La localización y expresión de la proteína diana.

Después de que la proteína recombinante se sintetiza en E. coli, hay 4 localizaciones, a saber, en el citoplasma, el espacio periplásmico, la membrana interna o externa y la matriz extracelular.

Utilice péptidos señal para secretar proteínas recombinantes en el periplasma o medio extracelular. El entorno oxidativo en el espacio periplásmico favorece la formación de enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de proteínas basadas en tio; la proteasa en el espacio periplásmico es menor que la de la célula Many, para reducir la degradación de la proteína diana; el número de proteínas en el espacio periplásmico también es mucho menor que el de la célula, lo que conduce a la purificación de la proteína diana.

(5) Selección de cepas de expresión.

Demasiadas proteasas endógenas en la cepa pueden provocar la inestabilidad de los productos de expresión exógenos. Por lo tanto, algunas cepas deficientes en proteasas a menudo se convierten en cepas de expresión inicial ideales.

La serie Rosetta2 complementa los ARNt (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA y CGG) correspondientes a siete codones raros que carecen de E. coli, y mejora el nivel de expresión de genes extraños, especialmente genes eucariotas, en el sistema procariota; K -12 Las cepas derivadas de la serie Origami 2, las cepas de doble mutante trxB y gor aumentan significativamente la probabilidad de formación de enlaces disulfuro en el citoplasma y promueven la expresión de proteínas solubles. Rosetta-gami ™ combina las ventajas de los dos tipos de cepas anteriores.

No solo complementa 7 tipos de codones raros, sino que también promueve la formación de enlaces disulfuro y ayuda a expresar proteínas eucariotas que requieren la ayuda de enlaces disulfuro para formar una conformación plegada correcta.

(6) Condiciones de inducción y condiciones de cultivo

Las condiciones de inducción y las condiciones de cultivo también son críticas para la expresión de proteínas recombinantes, como la temperatura. Cuando la temperatura es más alta, la expresión de la proteína es alta pero es fácil formar cuerpos de inclusión, mientras que cuando la temperatura es baja, la expresión de la proteína es baja, pero puede aumentar la solubilidad de la proteína diana; la concentración de inductor también afecta la eficiencia de expresión de la proteína recombinante, como la inducción de IPTG de baja concentración puede aumentar el contenido de proteína soluble.

Además, la composición de nutrientes, el pH y otros parámetros del medio pueden afectar la actividad, secreción y nivel de expresión de la proteasa.