Etiquetas de purificación de expresión de proteínas
Tiempo de actualizacion : 2020-11-10
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Puntos de vista : 40
6 * Su etiqueta:
6 * His se refiere a una etiqueta de fusión compuesta por seis residuos de histidina, que pueden insertarse en el extremo C-terminal o N-terminal de la proteína diana.
Como etiqueta, se debe formar un epítopo para facilitar la purificación y detección; el otro es formar una característica estructural única (ligando de unión) para facilitar la purificación.
La cadena lateral de los residuos de histidina tiene una fuerte atracción por el níquel sólido y puede usarse para cromatografía de quelación de metales inmovilizados (IMAC) para separar y purificar proteínas recombinantes.
El uso de His-tag tiene las siguientes características:
1. El peso molecular de la etiqueta es pequeño, solo ~ 0,84 KD, lo que generalmente no afecta la función de la proteína objetivo;
2. La proteína de fusión de la etiqueta His se puede purificar en presencia de tensioactivos no iónicos o en condiciones desnaturalizantes. El primero se usa en la purificación de proteínas altamente hidrófobas y el último es particularmente útil en la purificación de proteínas de cuerpos de inclusión.
Una vez disuelto el desnaturalizante, la proteína de impureza se elimina mediante cromatografía de afinidad de quelación de metales, de modo que la renaturalización no se vea interferida por otras proteínas, o se renaturaliza la cromatografía de afinidad de quelación de metales;
3. La proteína de fusión de su etiqueta también se utiliza en el estudio de las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN;
4. Su etiqueta tiene una inmunogenicidad relativamente baja y la proteína purificada se puede inyectar directamente en animales para la preparación inmunitaria de anticuerpos;
5. Puede aplicarse a una variedad de sistemas de expresión, con condiciones de purificación suaves;
6. Puede usarse con otras etiquetas de afinidad para construir etiquetas de afinidad parentales.
Etiqueta GST:
La proteína etiqueta GST (glutatión sulfhidril transferasa) en sí misma es una transferasa que desempeña un papel importante en el proceso de desintoxicación y su tamaño natural es de 26 KD. Se utiliza principalmente en la expresión procariota.
Hay aproximadamente dos razones para su aplicación en la expresión procariota.
Uno es porque es una proteína altamente soluble y se espera que pueda usarse para aumentar la solubilidad de proteínas extrañas; la otra es que se puede usar en el intestino grueso. Una gran cantidad de expresión en el bacilo juega un papel en el aumento de la cantidad de expresión.
El sistema de expresión de fusión GST se usa ampliamente en la expresión de diversas proteínas de fusión y se puede expresar en células hospedadoras como E. coli y levadura.
La proteína de fusión unida se eluyó con glutatión reducido 10 mM en condiciones no desnaturalizantes. En la mayoría de los casos, la proteína de fusión es soluble en solución acuosa y forma un dímero.
Las etiquetas GST se pueden detectar fácilmente mediante análisis enzimático o inmunoensayo. Las etiquetas ayudan a proteger las proteínas recombinantes de la degradación por proteasas extracelulares y mejoran su estabilidad. En la mayoría de los casos, la proteína de fusión GST es total o parcialmente soluble.
Purificación: la proteína etiquetada con GST expresada por el sistema de expresión se puede purificar directamente del lisado bacteriano usando una resina de afinidad que contiene glutatión reducido (glutationesefarosa).
Las proteínas marcadas con GST se pueden eluir en condiciones suaves, no desnaturalizantes, por lo que se retienen la antigenicidad y la actividad biológica de la proteína.
GST perderá su capacidad de unirse a la resina de glutatión en condiciones desnaturalizantes, por lo que no se pueden agregar agentes desnaturalizantes fuertes como el clorhidrato de guanidina o la urea al tampón de purificación.
Si desea eliminar la parte de fusión de GST, puede utilizar la escisión de proteasa específica del sitio.
Detección: el anticuerpo GST o el anticuerpo específico de proteína diana expresado pueden usarse para la detección.
Etiqueta SUMO:
La proteína etiqueta SUMO es un modificador similar a la ubiquitina de molécula pequeña (modificador similar a la pequeñaubiquitina), y es uno de los miembros importantes de la superfamilia de cadenas polipeptídicas de ubiquitina.
En la estructura primaria, SUMO y ubiquitina tienen solo un 18% de homología, pero la estructura terciaria y las funciones biológicas de las dos son muy similares.
Los estudios han encontrado que SUMO se puede utilizar como etiqueta de fusión y chaperona molecular para la expresión de proteínas recombinantes.
No solo puede aumentar aún más la expresión de la proteína de fusión, sino que también tiene la función de resistir la hidrólisis de la proteasa, promover el plegamiento correcto de la proteína diana y mejorar la solubilidad de la proteína recombinante.
Además, SUMO tiene una aplicación importante, es decir, se puede utilizar para eliminar completamente la proteína etiqueta para obtener proteína natural.
Porque la enzima proteolítica SUMO puede reconocer la secuencia completa de la proteína etiqueta SUMO y puede cortar de manera eficiente SUMO de la proteína de fusión.
Después de eliminar el SUMO, después de la cromatografía de afinidad, se elimina la parte de la proteína etiqueta y la proteína recombinante es la misma que la proteína natural.
Por lo tanto, la etiqueta SUMO también se usa a menudo junto con otras etiquetas, como un sitio de digestión enzimática específico.
Etiqueta MBP:
La proteína etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa) tiene un tamaño de 40 kDa y está codificada por el gen malE de E. coli K12. La MBP puede aumentar la solubilidad de proteínas de fusión sobreexpresadas en bacterias, especialmente proteínas eucariotas. La etiqueta MBP se puede detectar fácilmente mediante inmunoensayo. Es necesario escindir la etiqueta con una proteasa específica del sitio. Si la proteína se expresa en bacterias, la MBP se puede fusionar al extremo N-terminal o al C-terminal de la proteína.
Purificación: la proteína de fusión se puede purificar aún más mediante una capa de afinidad de almidón reticulado. La proteína de fusión unida se puede eluir con maltosa 10 mM en tampón fisiológico. La afinidad de unión está en el rango micromolar. Algunas proteínas de fusión no se pueden unir eficazmente en presencia de Triton X-100 al 0,2% o Tween 20 al 0,25%, mientras que otras proteínas de fusión no se ven afectadas. La condición del tampón es pH 7,0 a 8,5 y la concentración de sal puede ser tan alta como 1 M, pero no se pueden usar desnaturalizantes. Si desea eliminar la parte de fusión de MBP, puede utilizar la escisión de proteasa específica del sitio.
Detección: el anticuerpo MBP o el anticuerpo específico de proteína diana expresado pueden usarse para la detección.
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