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Protocolo de expresión y purificación de proteínas

Tiempo de actualizacion : 2020-10-15

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Puntos de vista : 52

Protocolo de expresión y purificación de proteínas

El estudio de las funciones de las proteínas y la producción de proteínas funcionales son básicamente inseparables de la expresión y purificación heteróloga de proteínas.

Hoy les hablaré sobre la expresión y purificación de proteínas desde los siguientes aspectos.


1. Selección de etiquetas


Las etiquetas de expresión habituales en la actualidad son la etiqueta His (etiqueta de histidina), la etiqueta GST (etiqueta de glutatión sulfhidril transferasa), la etiqueta MBP (etiqueta de proteína de unión a maltosa), la etiqueta de CBD (etiqueta de región de unión a quitina).

Cada etiqueta tiene propiedades únicas, como el peso molecular de la etiqueta, su capacidad para regular la solubilidad de las proteínas, su efecto sobre el plegamiento de las proteínas, si es necesario extirparlas, etc.

Elige una etiqueta adecuada según las características de la proteína que quieras depurar. La etiqueta se selecciona bien y los experimentos posteriores obtendrán el doble de resultado con la mitad del esfuerzo.

2. Construcción de vectores


Después de seleccionar la etiqueta que se utilizará, es necesario preparar un vector de expresión. En la actualidad, hay muchos vectores comercializados para elegir, como la serie pET28 con His-tag y la serie pMAL con MBP-tag.

La mayoría de las series de vectores incluyen la forma de insertar la etiqueta en el N-terminal o C-terminal, que se puede seleccionar de manera flexible de acuerdo con las características de la proteína.

Al insertar el gen que codifica la proteína, debe prestar atención para evitar el cambio de marco. Si desea construir un vector desde cero, no olvide insertar un promotor adecuado y una secuencia de terminación de la transcripción. Las secuencias promotoras generalmente usan promotores inducibles, los promotores constitutivos causarán una expresión y acumulación prematuras de proteínas extrañas, lo que no conduce a la proliferación del hospedador.


3. Selección de anfitrión


Los huéspedes comunes son E. coli, células de mamíferos, levaduras e insectos. Para E. coli, la cepa más adecuada para la expresión heteróloga es BL21 y sus cepas derivadas, pero aún debe seleccionarse de acuerdo con los elementos de transcripción y traducción seleccionados en el vector.


Falta el gen de la proteasa endógena en BL21, por lo que es una cepa adecuada para la expresión de proteínas extrañas, pero no tiene ARN polimerasa T7, por lo que no puede usarse para la expresión de proteínas que contengan el promotor T7; BL21 (DE3), en BL21 Basado en la integración del genoma del fago T7, es adecuado para sistemas de expresión T7, como la serie pET; BL21 (DE3) PLySs, basados en BL21 (DE3), con el gen de la lisozima T7, que puede controlar más estrictamente la expresión de la polimerasa T7.


Cabe señalar que debido a la existencia de genes como la endonucleasa (endA1) recombinasa (recA1), el plásmido no es tan estable en la serie de cepas BL21, pudiendo integrarse en el genoma, pérdida, mutación, etc. así que construya un buen vector. Todavía necesita ser almacenado en cepas como DH5α.


4. Optimización de las condiciones de cultivo


Tomando el sistema de expresión de E. coli como ejemplo, el medio LB puede usarse tanto para reanimación como para cultivo de semillas.

Es mejor utilizar un medio con mayor contenido de aminoácidos pero una fuente de azúcar más baja durante la etapa de fermentación, como el medio TB para promover la síntesis y acumulación de proteínas.

Si se usa un promotor inducible, debe agregarse un inductor como IPTG cuando las bacterias crezcan hasta la fase de crecimiento logarítmico tardío.

Después de agregar el inductor, la temperatura del cultivo debe reducirse a 16-30 ° C. Cuanto menor sea la temperatura del cultivo, más lenta será la acumulación de proteína y menos probable es que se produzcan cuerpos de inclusión.


5. Selección del material de la columna de purificación

Cada etiqueta tiene un material de columna de purificación correspondiente. La etiqueta GST usa gel de glutatión, la etiqueta MBP usa resina de polisacárido, la etiqueta CBD usa resina de quitina y la etiqueta His usa rellenos junto con iones metálicos divalentes, el más común de los cuales está acoplado con níquel iónico, comúnmente conocido como columna de níquel.

El empaque de columna de níquel NEBExpress (S1428S) se lanzó recientemente en noviembre de 2019. También hay una forma de columna de giro preempaquetada (S1427S / L), que es más adecuada para la purificación de proteínas pequeñas en la etapa de cribado. La purificación de 1 mg de proteína marcada con His solo toma 15 minutos.

Cada relleno de columna de níquel de 1 ml puede purificar ≥10 mg de proteína marcada con histidina;

Unión altamente específica a proteínas con etiqueta His, pureza> 95% después de la separación y purificación;

La fuerte unión de iones de níquel lo hace extremadamente resistente al EDTA y los agentes reductores, y es compatible con los reactivos de lisis celular a base de detergente comunes.