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Método de diseño de cebadores de clonación por PCR

Tiempo de actualizacion : 2020-08-17

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Método de diseño de cebadores de clonación por PCR

La clonación por PCR es una tecnología de biología molecular que amplifica y expande fragmentos de ADN específicos y se utiliza ampliamente en biología molecular y campos relacionados.

Entre ellos, el cebador de clonación de PCR es un factor importante en el proceso de reacción de expansión de PCR. Por lo tanto, antes de que se inicie oficialmente el experimento de clonación por PCR, es necesario dominar el método correcto de diseño de cebadores de clonación por PCR.


Proceso de diseño de cebadores de clonación por PCR:


Obtenga la secuencia del fragmento de extensión de PCR: en el primer caso, expanda basándose en fragmentos conocidos, y necesita diseñar cebadores de expansión de PCR mediante la búsqueda NCBI de secuencias de genes; en el otro caso, expanda fragmentos de genes desconocidos, necesita buscar secuencias conservadoras de especies relacionadas, basadas en secuencias conservadoras de ADN o ARN como plantilla para diseñar cebadores.


Por ejemplo, el software de diseño de imprimaciones Prime Premier 5.0 es potente y fácil de usar. Puede comparar y evaluar exhaustivamente el diseño de imprimaciones. Es uno de los programas informáticos más utilizados para el diseño de imprimaciones.


Verificación de la prueba de extensión por PCR: la amplificación por PCR se puede llevar a cabo después de que se complete la síntesis del cebador, y la exactitud de los cebadores de clonación por PCR se puede predecir en función de la longitud del producto amplificado mediante electroforesis en gel.


Precauciones para el diseño de cebadores de clonación por PCR:


La longitud del cebador se mantiene básicamente entre 18-24 pb. Si la longitud de la secuencia del cebador es demasiado corta, puede expandirse y afectar la velocidad de expansión de la clonación por PCR; si la longitud del cebador es demasiado larga, no se puede aumentar la reducción del cebador, pero la secuencia demasiado larga provocará desajustes y reducirá la tasa de expansión de la clonación por PCR.


Por lo tanto, el valor de Tm apropiado es 55-80 ° C, y la diferencia de temperatura de inicio entre los cebadores aguas arriba y aguas abajo debe estar dentro de los 10 ° C.

Por tanto, el contenido de GC de la extensión afectará a la temperatura de fusión del oligonucleótido durante el proceso de clonación por PCR, es decir, el valor de Tm.

Generalmente, el contenido de GC de la extensión está entre el 40% y el 60%, y la diferencia de contenido de GC entre los cebadores aguas arriba y aguas abajo está dentro del 20%, lo que puede aumentar el contenido del cebador.



Si esto sucede, pueden ocurrir desajustes durante el proceso de PCR, lo que afectará la precisión de la amplificación por PCR.

Evitar que la hebra única del cebador de amplificación forme una estructura secundaria durante el proceso de clonación por PCR e inhibir el proceso de expansión de la PCR.


La plataforma de Generalbiosystems utiliza tecnología de clonación patentada para ayudar a los clientes a clonar el gen objetivo en cualquier posición designada en el vector deseado sin depender de los sitios de restricción de vectores para cumplir con varios planes de diseño de clonación para los clientes.