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¿Cómo lidiar con los cuerpos de inclusión en los experimentos de expresión de proteínas?

Tiempo de actualizacion : 2021-01-05

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¿Cómo lidiar con los cuerpos de inclusión en los experimentos de expresión de proteínas?
¿Qué problemas encuentra a menudo la expresión de proteínas? Los cuerpos de inclusión son uno de ellos. Para la mayoría de los experimentos, los cuerpos de inclusión son como costillas de pollo. Sin embargo, este es a menudo un problema que debe tratarse en el proceso de expresión de proteínas procariotas.

La mejor forma es, por supuesto, evitar la aparición de cuerpos de inclusión, pero también hay muchas proteínas que no se pueden obtener en la forma sobrenadante durante la expresión procariota. En este momento, la renaturalización de los cuerpos de inclusión en proteínas activas se convierte en la mejor opción.
怎样 处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?

Separación y lavado de cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión tienen una densidad más alta que otros componentes, por lo que pueden recolectarse mediante centrifugación. Después de tratar las bacterias con lisozima, las células suelen romperse mediante homogeneización a alta presión.

Dado que los liposomas y las membranas celulares parcialmente rotas y las proteínas de membrana pueden adherirse a los cuerpos de inclusión, los cuerpos de inclusión deben lavarse antes de la desnaturalización y disolución, normalmente con una baja concentración de desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidina 0,5-1 M o urea.

Además, también se puede lavar con un detergente suave al 1% TritonX-100 o desoxicolato de sodio para eliminar fragmentos de membrana y proteínas de membrana.

Degeneración de cuerpos de inclusión

Resuspenda e incube los cuerpos de inclusión en tampón que contenga desnaturalizante y agente reductor (generalmente DTT 20 mM o β-mercaptoetanol). La adición de un agente reductor puede mantener la Cys en un estado reducido. También puede romper los enlaces disulfuro de las proteínas.

La temperatura de incubación durante el proceso de desnaturalización generalmente se mantiene a 30 ° C para promover la disolución de las proteínas. La optimización de varias condiciones en este proceso está determinada por las características de la proteína específica, y se puede realizar un experimento a pequeña escala para encontrar las mejores condiciones de disolución.
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¿Cómo lidiar con los cuerpos de inclusión en los experimentos de expresión de proteínas?

Las siguientes son las condiciones experimentales para la desnaturalización en general:

Una vez que se completa la desnaturalización de los cuerpos de inclusión, se requiere centrifugación para eliminar los insolubles restantes; de lo contrario, los insolubles restantes pueden causar agregación de proteínas y precipitación durante el proceso de replegamiento de la proteína diana. Lo mejor es utilizar ultracentrifugación (100000 g, 30 minutos) para la centrifugación.

Replegamiento de proteína soluble

El primer paso de la renaturalización es eliminar el desnaturalizante. Los principales factores desfavorables en el proceso de renaturalización de proteínas son el plegamiento incorrecto y la precipitación de proteínas.

Para evitar la precipitación de proteína durante el proceso de renaturalización, es necesario reducir la concentración de proteína y el rango de concentración de proteína se controla dentro de 10-100 mg / ml.

Para diferentes proteínas, las condiciones de renaturalización deben optimizarse. Los factores importantes en el proceso de renaturalización son los siguientes:
  • Composición del tampón (pH, concentración);
  • la temperatura;
  • Aditivos (normalmente se utilizan varios aditivos juntos).

Se eliminan el agente desnaturalizante y el agente reductor, y la molécula de proteína desnaturalizada se proporciona con un entorno correcto de replegamiento y recuperación de la actividad, y se puede obtener la proteína activa natural. Los métodos de renaturalización más comunes utilizados son diálisis, dilución, cromatografía, etc.

La diálisis es el método más utilizado en los laboratorios, pero lleva mucho tiempo y forma fácilmente agregados de proteínas inactivas. MaedaY diseñó un método de diálisis lento, utilizando una solución de urea de 8 mol / L como dializado inicial y luego aumentando gradualmente la solución sin urea para reducir la concentración de desnaturalizante.

En este método, la concentración de desnaturalizante disminuye de manera más continua y lenta, y no hay mutación en la concentración de desnaturalizante en el método de dilución, lo que puede ayudar a reducir la precipitación durante la renaturalización de ciertas proteínas y aumentar el rendimiento de proteínas activas. Con este método, la tasa de renaturalización de IgG alcanzó el 70% a 1 mg / ml.

La dilución es el método de replegamiento más simple y eficaz. Después de la dilución, cuando el desnaturalizante y el agente reductor caen a una cierta concentración, las moléculas de proteína comienzan a replegarse, pero la cantidad de líquido procesado es grande, lo que no favorece la amplificación industrial. Los métodos de dilución actuales incluyen principalmente la dilución de una sola vez, la dilución segmentada y la dilución en serie.

La renaturalización cromatográfica es un método de renaturalización que se ha estudiado con más frecuencia. Las columnas cromatográficas se utilizan para eliminar desnaturalizantes. Los métodos cromatográficos comúnmente usados incluyen tamices moleculares, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Cuando la proteína migra lentamente en la columna, el desnaturalizante se puede eliminar o la proteína se une a la columna de cromatografía y se separa del desnaturalizante. La renaturalización cromatográfica se usa generalmente para la renaturalización de proteínas a gran escala, y la concentración de proteína de renaturalización varía hasta mg / ml.


Si encuentra demasiados cuerpos de inclusión en el experimento, también puede probar los métodos anteriores. Si aún no puede resolverlo, también puede considerar a Generalbiosystems para que lo ayude. Somos una empresa profesional de preparación de proteínas recombinantes.