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Métodos y precauciones para la purificación de proteínas.

Tiempo de actualizacion : 2020-10-26

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Métodos y precauciones para la purificación de proteínas.
El primer paso en la investigación de proteínas es separar y purificar la proteína objetivo de una mezcla compleja de macromoléculas para obtener un objetivo de alta pureza con actividad biológica. Por lo tanto, las técnicas y métodos eficientes de purificación de proteínas son una de las bases y claves importantes de la investigación de proteínas.

Método de extracción y purificación de proteínas.

Extracción de proteínas (incluidas enzimas)

La mayoría de las proteínas son solubles en agua, sal diluida, ácido diluido o soluciones alcalinas, y algunas proteínas unidas a lípidos son solubles en disolventes orgánicos como etanol, acetona, butanol, etc. Por lo tanto, se pueden utilizar diferentes disolventes para la extracción, separación y purificación. Proteínas y enzimas.

(1) Método de extracción de solución acuosa

La solución acuosa de sal diluida y el sistema tampón tiene buena estabilidad y alta solubilidad para las proteínas. Es el disolvente más utilizado para la extracción de proteínas.

La cantidad habitual es de 1 a 5 veces el volumen de la materia prima. La extracción requiere una agitación uniforme para facilitar la disolución de las proteínas. La temperatura de extracción depende de la naturaleza de los ingredientes activos.


Por un lado, la solubilidad de la mayoría de las proteínas aumenta a medida que aumenta la temperatura. Por tanto, las temperaturas más elevadas favorecen la disolución y acortan el tiempo de extracción.

Pero por otro lado, el aumento de temperatura desnaturalizará e inactivará la proteína. Por lo tanto, con base en este punto, la extracción de proteínas y enzimas generalmente utiliza una operación a baja temperatura (menos de 5 grados).

Para evitar la degradación durante la extracción de proteínas, se pueden agregar inhibidores de enzimas proteolíticas (como diisopropil fluorofosfato, ácido yodoacético, etc.).



(2) Método de extracción con solvente orgánico

Algunas proteínas y enzimas que están unidas más firmemente a los lípidos o que tienen más cadenas laterales no polares en la molécula son insolubles en agua, soluciones salinas diluidas, ácidos diluidos o álcalis diluidos.

Se pueden utilizar disolventes orgánicos como etanol, acetona y butanol. Tiene cierta hidrofilia y una fuerte lipofilia. Es una solución de extracción de lipoproteínas ideal. Pero debe operarse a bajas temperaturas.


El método de extracción con butanol es particularmente superior para extraer algunas proteínas y enzimas que están fuertemente unidas a los lípidos. Una es que el butanol tiene una fuerte lipofilia, especialmente su capacidad para disolver fosfolípidos; la otra es que el butanol tiene tanto hidrofilicidad como dentro del rango de solubilidad.

(El grado es 10%, 40 grados es 6.6%) no causará desnaturalización e inactivación de enzimas. Además, el método de extracción con butanol tiene una amplia gama de opciones de pH y temperatura, y también es adecuado para materiales animales, vegetales y microbianos.


Precauciones para la extracción y purificación de proteínas:


A la hora de depurar cualquier tipo de proteína, siempre debes prestar atención a mantener su estabilidad y proteger su actividad. Hay que tener en cuenta algunas precauciones generales. Incluyen:

1. La operación debe colocarse en hielo o en una cámara frigorífica en la medida de lo posible.

2. No se diluya demasiado, mantenga la concentración de proteína en μg / mL ~ mg / mL.

3. pH adecuado, a menos que se realice una cromatografía de enfoque, la solución tampón utilizada debe evitar el mismo pH que el pI para evitar la precipitación de proteínas.

4. Utilice inhibidores de proteasa para evitar que la proteasa degrade la proteína diana; al purificar la proteína en la célula, agregue DNasa para degradar el ADN y evitar que el ADN contamine la proteína.

5. Evite la congelación y descongelación repetidas y la agitación vigorosa de la muestra para evitar la desnaturalización de las proteínas.

6. Los componentes de la solución tampón imitan el entorno intracelular tanto como sea posible.

7. Añada 0,1 ~ 1 mmol / LDTT (ditiotreitol) (o β-mercaptoetanol) a la solución tampón para evitar la oxidación de las proteínas.

8. Agregue 1 ~ 10 mmol / LEDTA agente quelante de metales para evitar que los metales pesados dañen la proteína objetivo.

9. Utilice una solución esterilizante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

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