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Métodos de síntesis de genes

Tiempo de actualizacion : 2020-08-25

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Métodos de síntesis de genes

Los métodos de síntesis de genes incluyen principalmente PCR de ensamblaje, PCR de extensión por superposición, método TBIO y método PTDS.


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Antes de la síntesis de genes, para permitir que los genes se expresen bien en diferentes sistemas de expresión biológica, los investigadores suelen realizar la optimización de codones en los genes.

Hay 64 códigos genéticos, pero la mayoría de los organismos tienden a usar algunos de estos codones. Los que se utilizan con mayor frecuencia se denominan codones óptimos y los que no se utilizan con frecuencia se denominan codones raros o poco utilizados.


En realidad, todos los organismos utilizados para la expresión o producción de proteínas (incluidas E. coli, levaduras, células de mamíferos, células vegetales y células de insectos) exhiben un cierto grado de preferencia de codones.

Por tanto, la expresión de proteínas recombinantes puede verse afectada por codones. El impacto de la utilización infantil (especialmente en sistemas de expresión heterólogos).


Sin cambiar su proteína codificante, el proceso de cambiar el gen codificante de una proteína, eliminar codones raros y optimizar razonablemente su estructura secundaria de ARNm, contenido de GC, etc. se denomina optimización de codones.

El principio de optimización de codones es seleccionar diferentes codones para cada aminoácido en la secuencia de la proteína diana de acuerdo con la preferencia de codones del sistema de expresión que se utilizará para realizar la combinación de toda la secuencia y encontrar la mejor.


1. Síntesis de cebadores
Una vez que los investigadores determinan la secuencia del gen sintético de acuerdo con sus propios deseos, dado que no existe una plantilla, primero deben diseñar y sintetizar cebadores basados en el ADN de doble hebra que se va a sintetizar.
En la actualidad, la síntesis de cebadores adopta básicamente el método de triéster de fosforamidita en fase sólida. El método del triéster de fosforamidita para sintetizar fragmentos de ADN tiene las características de alta eficiencia, acoplamiento rápido y reactivos iniciales relativamente estables.
2. Amplificación por PCR con cebadores como plantillas
Una vez que se sintetizan los cebadores, los cebadores sirven como plantillas para la amplificación por PCR. El principio básico de la tecnología de la PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos complementarios a ambos extremos de la secuencia diana.
3. Transformación de conexión, inspección y prueba de bacterias
Mediante la reacción de PCR, el ADN de doble hebra que necesitamos se puede amplificar. Pero la estabilidad del producto de PCR es baja, necesitamos ligarlo al plásmido, transformarlo en un estado competente y esparcirlo en una placa durante la noche. Los clones positivos se pueden recoger de la placa a la mañana siguiente. Los clones recogidos deben verificarse nuevamente mediante PCR de colonias para verificar si hay una inserción de genes de longitud completa. La PCR se realiza con los cebadores de cabeza y cola. Si hay un producto, indica que hay un gen diana. Los clones verificados se transforman en bacterias de agitación de cultivo en tubos de ensayo, después de lo cual los plásmidos se extraen, purifican y envían para secuenciación.
4. Secuenciación de primera generación
Actualmente, utilizamos la secuenciación de primera generación, también llamada secuenciación de Sanger. La secuenciación de Sanger usa una ADN polimerasa para extender un cebador unido a una plantilla de una secuencia pendiente hasta que se incorpora un nucleótido de terminación de cadena. Cada determinación de secuencia consiste en un conjunto de cuatro reacciones separadas, cada una de las cuales contiene los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP), mezclados con una cantidad limitada de un didesoxinucleótido trifosfato diferente (ddNTP).
5. Verificación de control de calidad

El resultado de la secuenciación se compara con el gen diana y al mismo tiempo se realiza la verificación de la digestión de la enzima QC. Si el resultado de la secuenciación y el resultado de la verificación de la digestión son correctos, la síntesis del gen diana se completa. De acuerdo con los pasos anteriores, se puede sintetizar una secuencia de genes de aproximadamente 800 pb en 5 días en condiciones suaves.