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Cuatro enfoques de subclonación

Tiempo de actualizacion : 2020-08-06

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Puntos de vista : 79

Cuatro enfoques de subclonación
Desde la perspectiva de una empresa que se especializa en servicios de subclonación , generalbiosystems le proporcionará respuestas a los enfoques utilizados por la subclonación.

✦ Digestión de restricción

Las endonucleasas de limitación (RE), también denominadas enzimas de restricción, son proteínas que identifican series de ADN cortas y detalladas (típicamente palindrómicas). Los RE de tipo II escinden el ADN de doble hebra (dsDNA) en ciertos sitios web dentro o al lado de sus secuencias de reconocimiento.

Ciertamente, muchas enzimas de limitación no reducirán el ADN que está metilado en uno o ambos pelos del sitio de reconocimiento, aunque algunas exigen la metilación del sustrato.


Digestión de restricción parcial

Control de la frecuencia de corte en la digestión de restricción

La visibilidad de un sitio web de reconocimiento de limitaciones en la inserción y también la región de clonación múltiple no impide necesariamente el uso de ese sitio web de restricción en una técnica de subclonación. En condiciones típicas de absorción por restricción, la enzima está en exceso para asegurarse de que todos los sitios de reconocimiento en el plásmido puedan escindirse.

Puede manipular las condiciones de resumen de restricciones de modo que sin duda digerir solo una parte de los sitios web.

De hecho, se han utilizado muchos enfoques para hacer digestiones parciales: disminuir el nivel de temperatura de reacción, hacer uso de una barrera no óptima y disminuir los sistemas de enzimas.


Vectores desfosforilantes para limitar la autoligación

Detener la autoligación del vector es esencial para reducir el historial de subclonación. La eficacia de ligar el plásmido consigo mismo es mucho mejor que ligar una pieza separada de ADN directamente en el vector y es la respuesta preferida. La eliminación de los fosfatos 5 'del vector linealizado evitará que la ADN ligasa de T4 recircularice el vector. La fosfatasa alcalina intestinal de ternera es la enzima atemporal para la desfosforilación de vectores.

La enzima se puede utilizar en los extremos rebajados 5 '(es decir, surge de una enzima que deja un saliente 3'), salientes 5 'así como bluntends.

Después de la desfosforilación, la enzima debe eliminarse mediante purificación directa o electroforesis en gel y también mediante aislamiento en gel con sistemas de filtración de ADN como el gel y el sistema de limpieza de PCR.

La fosfatasa alcalina de camarón se puede utilizar en lugar de la fosfatasa alcalina del tracto intestinal del hueso de la pantorrilla y también proporciona el beneficio de la desnaturalización con calor simple para suspender la enzima sin la necesidad de una filtración adicional.


Vector purificador e inserto

La filtración del inserto y el vector de ubicación son absolutamente esenciales para el éxito de las aplicaciones de subclonación.

Hace años, cada paso requería extracciones de fenol: cloroformo adheridas por la lluvia de etanol para eliminar enzimas como la fosfatasa alcalina digestiva de terneros de los controles de vectores químicos.

Los sistemas de limpieza de ácidos nucleicos basados en guanidina simplificaron significativamente la eliminación de enzimas.

Los enfoques de aislamiento en gel mejoraron aún más la eficacia de la subclonación separando los catalizadores deseados de los reactantes indeseables.