Factores que afectan la purificación de proteínas de tejidos vegetales.

Las plantas tienen algunos problemas especiales en la purificación de proteínas , lo que hace que el rendimiento de proteína por unidad de volumen sea menor que el de los animales o procariotas, y la destrucción de tejidos, la interferencia con la purificación y la presencia de sustancias naturales con efectos oxidativos pueden afectar la actividad enzimática.

Es importante elegir cuidadosamente la fuente del material y el método adecuado de fragmentación del tejido. Una vez que la proteína está en una forma separable, la proteína vegetal se puede procesar como otras proteínas utilizando métodos de purificación generales.

Baja concentración de proteínas

A diferencia de la mayoría de los otros organismos, la gran cantidad de materia sólida en las plantas no es proteína, sino otras sustancias macromoleculares, como almidón, celulosa, pectina y hemicelulosa y polifenoles.

La homogeneización inicial debe realizarse en una gran cantidad de tampón para la filtración preliminar. Una gran cantidad de sustancias insolubles afectará a la filtración debido al efecto gel o al simple efecto de adsorción.

Por lo tanto, inicialmente solo se puede obtener una baja concentración de proteína, que debe precipitarse o concentrarse. Después de la homogeneización, la precipitación con sulfato de amonio y la precipitación con PEG se utilizan comúnmente para las proteínas vegetales.

Si se utiliza ultrafiltración para la concentración, se debe considerar la capacidad de la proteína vegetal para unirse a la membrana para evitar efectos negativos.

Proteólisis

La purificación de proteínas vegetales a veces tiene el problema de la proteólisis, a menudo acompañada de una disminución en la concentración de proteína inicial, que puede deberse al largo tiempo de operación del paso inicial o la presencia de proteasa.

Las principales enzimas proteolíticas contenidas en las plantas incluyen serina proteasas, cisteína proteasas y metaloproteasas, y pueden usarse los inhibidores correspondientes. 1 mmol / L de PMSF es adecuado para la inhibición de serina proteasas.

Inhibición y pardeamiento

Muchos tejidos vegetales son ricos en oxidasas, que actúan sobre sustratos endógenos para producir productos activos, que los inactivan después de reaccionar con enzimas, que pueden ser parte del mecanismo de defensa natural de las plantas. La polifenol oxidasa está presente en muchas plantas, como las patatas, las manzanas, los plátanos y la remolacha azucarera, y provoca reacciones de pardeamiento, especialmente cuando hay tirosina libre.

En otras plantas, como los frijoles, una gran cantidad de peroxidasa liberada cuando se rompe el tejido también puede provocar una reacción de pardeamiento. La reacción de pardeamiento se puede reducir eliminando el sustrato o inhibiendo la oxidasa.

Se puede usar resina catiónica (como Dowe × 1 × 2) o resina de interacción hidrófoba (como Am berlita XAD-2) para eliminar el sustrato de reacción. El inhibidor de la reacción puede ser tiol, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol, o ácido ascórbico (pero preste atención al efecto sobre el pH del tampón homogéneo) o metabisulfito de sodio.