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Factores que afectan la expresión de proteínas

Tiempo de actualizacion : 2020-10-27

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Puntos de vista : 37

Factores que afectan la expresión de proteínas

Al realizar experimentos de expresión de proteínas , a veces el experimento siente que no hay ningún problema con el método del experimento de referencia y la secuencia del gen de la proteína clonada, y la electroforesis de proteínas no tiene resultados.

Se resumen las razones por las que la proteína no se expresa.


1. Construcción de vector incorrecta. Esto no es infrecuente y muchos clonadores nuevos a menudo confunden el marco de lectura. Por ejemplo, los vectores de la serie pQE de Qiagen a menudo tienen una diferencia de una o dos bases en sus sitios de clonación; Además, algunas enzimas producen extremos pegajosos y algunas enzimas producen extremos romos, que pueden conducir fácilmente a errores en el marco de lectura y, por lo tanto, no se expresan.

2. Selección incorrecta de bacterias hospedadoras. Las diferentes bacterias hospedadoras tienen diferentes genotipos.

Para algunos vectores especialmente modificados, o vectores para fines especiales, o vectores con promotores especiales, se deben seleccionar bacterias hospedadoras adecuadas para la expresión.


Por lo tanto, cuando su proteína no se expresa, puede considerar reemplazar la bacteria huésped.


3. La frecuencia de uso de codones es baja. Algunos genes mismos contienen muchos codones raros, especialmente los codones raros dentro de las 15 bases después del codón de inicio, que tienen una influencia muy importante en la expresión de proteínas. Los codones optimizados parecen tener un buen efecto sobre la expresión procariota, pero no han visto un buen efecto sobre los sistemas de expresión eucariotas.

4. El plásmido es inestable o se pierde. Los sistemas pET suelen ser relativamente estables. Pero cuando elige un vector con resistencia a la ampicilina, puede ser posible producir β-galactosidasa que degrada el antibiótico y pierde el plásmido.

Otra situación es la expresión de la proteína toxina recombinante, que también es tóxica para las células huésped, provocando la pérdida de plásmido. Esta situación es más común en los sistemas de expresión eucariotas.


5. La proteasa degrada la proteína. Esta situación a menudo es causada por la secuencia N- o C-terminal de la propia proteína recombinante. Cuando el N-terminal de la proteína es Arg, Leu, Lys, Phe, Trp o Tyr, estos aminoácidos son propensos a la degradación por proteasa, que es la regla del N-terminal.

Cuando el N-terminal es Met, E. coli puede robar este Met silenciosamente, especialmente cuando Met va seguido de un aminoácido con una pequeña cadena lateral.

La presencia de aminoácidos no polares en el extremo C-terminal también puede conducir fácilmente a la degradación de las proteínas. Los últimos 5 aminoácidos en el C-terminal son polares o cargados y no se degradan fácilmente.


6. Sitio de inicio de la traducción secundaria. Este es el caso cuando su secuencia contiene exactamente la misma secuencia que el sitio de unión del ribosoma.

El ribosoma encontrará este sitio y comenzará a traducirse, lo que provocará que la proteína se trunque y no se puedan ver fragmentos del tamaño esperado durante la electroforesis.


7. Secuencia SD. La distancia entre la secuencia SD y la secuencia del codón de inicio (el 80% es AUG y GUG) también tiene un impacto muy importante en la eficiencia de la expresión de proteínas.

La composición de la propia secuencia SD también afecta la eficiencia de la traducción. A veces, para reducir la producción de cuerpos de inclusión, ¡la secuencia SD se modifica especialmente!


8. La estructura secundaria del ARNm. Antes de la clonación, debe ver si hay una secuencia complementaria al sitio de unión al ribosoma y / o al sitio de inicio de la traducción en su secuencia.

9. Terminación inesperada. Esta situación se ve en la amplificación de secuencias por PCR. Por ejemplo, mutará el TAC en el medio de la secuencia a TAA, lo que frenará la traducción de proteínas.

Por lo tanto, la secuenciación debe realizarse antes de la expresión para evitar esta situación.


10. Terminador de transcripción. La existencia de un terminador de la transcripción puede promover la expresión de proteínas; pero cuando falta, causará "lectura completa" y lectura interminable.

Esto no es un problema en el sistema pET porque tiene un gen marcador selectivo en la dirección opuesta al gen diana.

Si su gen objetivo está en la misma dirección que este gen marcador, entonces debe ver si hay un terminador de transcripción después de su gen objetivo.


11. La inestabilidad del ARNm. El ARNm del gen diana a menudo se acumula en la célula. Pero el ARNm de las bacterias coliformes es extremadamente inestable.

Si se inserta una secuencia estructural estable en la región no traducida 5 'y el terminador independiente de rho 3' del ARNm, se puede promover la estabilidad del ARNm.

Especialmente si el extremo 5 'tiene una estructura de horquilla sin sobresalir, puede inanimar el ARNm en el citoplasma.


12. La viabilidad del método de detección. A veces, la proteína se expresa de hecho, pero el nivel de expresión es extremadamente bajo o está tan cerca de la banda miscelánea que se piensa erróneamente que la proteína no se expresa.

En este momento, no debes olvidar las dos reglas de oro de los experimentos biológicos: control y repetición.



En resumen, cualquier material experimental es muy importante. La construcción correcta de vectores de expresión de proteínas es la base de los experimentos de expresión de proteínas.

Por tanto, debe garantizarse la exactitud de los vectores de expresión de proteínas. Una bacteria huésped adecuada también es la base de los experimentos de expresión de proteínas.


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