Hogar > Noticias > Noticias de la Industria

Estrategias comunes de subclonación

Tiempo de actualizacion : 2020-08-05

Fuente :

Puntos de vista : 88

Estrategias comunes de subclonación

Para estudiar la funcionalidad deseada de un inserto existe el requisito de transferirlos de un vector a otro, este procedimiento de transferencia se conoce como subclonación . Pasos de la subclonación:


  • Libera y purifica tu inserto del vector padre
  • Ligar este inserto en un vector de destino preparado
  • Transforma esta reacción de ligadura en células bacterianas competentes
  • Examine las células transformadas para el inserto

Diferentes estrategias de subclonación:

Para cualquier trabajo de subclonación, es necesario contar con algunos conocimientos previos sobre el vector y el inserto.

La información sobre los sitios RE disponibles en el vector principal de múltiples regiones de clonación, los sitios RE disponibles en el inserto (en caso de digestión insertada). También información sobre la recurrencia de sitios RE en múltiples regiones de clonación del vector de destino y sitios RE en el inserto.

Dependiendo de la diferente combinación de estos sitios, se decide la estrategia de subclonación que se utilizará.


✦ Sitios de restricción comunes

Se puede utilizar un proceso de subclonación sencillo si las regiones de clonación múltiple del vector principal y de destino contienen sitios de restricción comunes y ninguno de estos sitios de restricción se encuentra dentro de su inserto.

Tanto el vector padre como el de destino se digieren usando las mismas dos enzimas. A esto le sigue la desfosforilación del vector de destino. Separe tanto el inserto como el vector desfosforilado usando un gel de agarosa. Luego purifique el vector de inserción usando cualquier sistema de purificación de ADN. Finalmente, estos vectores e insertos se ligan.


Mover plaquitas con sitios de restricción compatibles

  Hay casos en los que los sitios de restricción en las regiones de clonación múltiples del vector padre y de destino no son comunes pero pueden ser compatibles. Los sitios de restricción compatibles tienen la misma secuencia saliente y se pueden ligar entre sí.

Después de la ligación, los sitios regenerados no se parecen a ambos sitios de restricción en las regiones de clonación múltiples del vector padre y de destino. Una vez identificadas las enzimas necesarias para la ligadura y restricción. Esta estrategia de clonación también se vuelve sencilla.


Mover plaquitas con un solo sitio común


La combinación de sitios de restricción comunes conduce a la posibilidad de una sola coincidencia en un lado de su inserto. El problema debe abordarse en el otro lado del encarte. Se puede usar un corte romo.

La acción de la T4 ADN polimerasa puede embotar cualquier sitio de restricción. Digiera el vector original y rompa ese sitio con T4 ADN polimerasa. Ejecute los productos en un gel, purifíquelos y proceda con la digestión con enzimas de restricción finales comunes o compatibles.

La mayoría de los vectores tienen al menos un sitio de restricción de extremos romos que puede aceptar el extremo romo recién creado del inserto.

Si no tiene un sitio de este tipo o si el sitio no estaría en la orientación correcta, se puede aplicar la misma estrategia de “cortar-cortar-cortar” al destino.


Método de punta roma

El escenario final de ningún sitio de restricción común es común o compatible con el vector padre o de destino.

EN este escenario, la mejor estrategia es amplificar el inserto con sitios de restricción en los cebadores para proporcionar compatibilidad. Pero este método tiene sus propios problemas.

Existe la posibilidad de mutaciones. Además, existe mucha dificultad en la digestión de los productos de PCR. Se puede utilizar una estrategia más en este escenario. Corta el inserto con las enzimas.

Tratar con T4 ADN polimerasa para romos los salientes 5 'o 3' y ligar en el vector de destino abierto con un cortador de extremos romos o embotado por T4 ADN polimerasa. Este método no puede retener la orientación del isert.