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Ventajas de los métodos de purificación de proteínas

Tiempo de actualizacion : 2020-12-09

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Puntos de vista : 29

Ventajas de los métodos de purificación de proteínas

Ya sea que se trate de investigación o aplicación de proteínas, generalmente es necesario expresar la proteína en diferentes sistemas biológicos (como E. coli, levadura, baculovirus de insectos, sistema de expresión de proteínas de células de mamíferos , etc.), y luego separarla y purificarla. Los laboratorios de investigación generalmente necesitan purificar microgramos o miligramos de proteína, mientras que la industria necesita purificar miles de gramos o incluso toneladas de proteína.


Mammalian cell protein

Por tanto, la purificación de proteínas es muy importante. Durante el proceso de purificación, es necesario considerar la contaminación del huésped, la solubilidad de la muestra, la integridad de la estructura de la proteína y la actividad biológica. La purificación de proteínas se puede dividir aproximadamente en tres etapas: captura de muestra, etapa de purificación intermedia y etapa de purificación fina.

Captura de muestras: tratamiento de separación, concentración y estabilización;

Purificación moderada: para eliminar el ácido nucleico y otros componentes celulares, se puede utilizar el método de precipitación con sulfato de amonio;

Purificación fina: distingue la proteína objetivo de otras proteínas con tamaño y propiedades físicas y químicas similares. Los métodos comunes incluyen cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Pauta de purificación de proteínas:


1. Objetivos claros, evitar la purificación excesiva o la purificación insuficiente;
2. Identificar las características de la muestra y las principales impurezas, y seleccionar el método de purificación adecuado;
La combinación de tecnología de purificación se puede determinar rápidamente detectando la ventana de estabilidad de la proteína (como el valor de pH, la fuerza iónica) y los datos básicos de la proteína (como el tamaño de la proteína, el punto isoeléctrico pl, la hidrofobicidad, la solubilidad, etc.).

3. Puede detectar rápidamente la tasa de recuperación, la actividad y las impurezas de la proteína;

4. Minimizar los pasos para evitar una pérdida excesiva de muestras y una reducción excesiva de la actividad;

5. Retire la proteasa y otras impurezas que puedan dañar la muestra lo antes posible;

6. Minimice el uso de aditivos; de lo contrario, es posible que se requieran pasos adicionales para eliminarlos.
Escherichia coli expression system

Ventajas de 6 métodos de purificación de proteínas:

Debido a las diferentes propiedades de las muestras y proteínas, y las impurezas que contienen, se requieren diferentes estrategias de purificación de proteínas.

Actualmente existen seis métodos de purificación de proteínas: cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, purificación de etiquetas, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis, etc. También se pueden utilizar otros métodos para la purificación de proteínas, como el uso de estabilidad térmica, estabilidad proteolítica y solubilidad de la proteína para purificar la proteína.


1 Cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel es un método eficaz de separación y purificación de proteínas que separa mezclas de proteínas en función de las diferencias de tamaño molecular.

Cuando la solución de proteína pasa a través de una columna de cromatografía de filtración en gel que contiene partículas empaquetadas, debido a que diferentes proteínas tienen diferentes tamaños moleculares, su capacidad para difundirse en partículas de un tamaño específico y tamaño de poro también es diferente.

Las proteínas grandes se eluyen primero y el peso molecular es menor. , Cuanto más tarde sea la elución, para lograr el propósito de separación y purificación de proteínas. En términos generales, cuanto más fina y larga sea la columna de cromatografía de filtración en gel, mejor será el efecto de purificación.


Esta tecnología tiene muchas ventajas: es suave, la muestra no se desnaturaliza fácilmente, apenas tiene efecto con las proteínas, tiene buena repetibilidad, no utiliza disolventes orgánicos y tiene una alta tasa de recuperación.

Este método se puede utilizar para la purificación de proteínas, determinación del peso molecular y su rango de distribución, sustitución de tampones, desalación, etc.


2 Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica para separar y purificar proteínas según el tipo, la cantidad y la distribución de cargas en la superficie de la proteína. En determinadas condiciones, las proteínas de carga puntual pueden combinarse con la columna de intercambio catiónico / aniónico y mostrar una fuerza de unión. diferencia.

La unión es reversible y se eluye gradualmente en el orden de unión débil a fuerte durante la cromatografía de intercambio iónico para realizar la separación y purificación de la proteína.

Esta tecnología tiene las ventajas de alta resolución, alta capacidad de intercambio de proteínas, aplicación flexible, principio de separación claro, operación simple, etc.

Es adecuado para aplicaciones a escala industrial y de laboratorio, mientras que la filtración en gel es difícil de lograr en aplicaciones a escala industrial.


3 Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad utiliza la adsorción reversible específica de macromoléculas y ligandos biológicos para separar y purificar proteínas. Este método tiene las ventajas de alta especificidad, condiciones suaves, velocidad rápida, alta eficiencia, etc., y es adecuado para purificar proteínas diana de muestras complejas y muestras con alto contenido de impurezas.

Se puede usar la adsorción específica de la proteína diana y el ligando, o se puede usar la unión específica entre el marcador y el ligando para lograr la separación y purificación de proteínas añadiendo un marcador.


4 Purificación de etiquetas

La purificación de etiquetas utiliza tecnología de recombinación genética para agregar algunos aminoácidos adicionales al extremo amino o carboxilo de la proteína como etiqueta, lo que facilita la separación y purificación. Las etiquetas comunes incluyen GST, His, MBP, Strep-tag ™ II, etc.

Etiqueta GST: agregue glutatión S transferasa (GST) a la secuencia de proteínas, luego use Glutatión Sefarosa 4B para la purificación por afinidad y córtela con trombina o factor Xa. El método tiene condiciones suaves y puede retener la antigenicidad y función de la proteína diana.

Su etiqueta: Histidina (His) es una de las etiquetas comunes, porque la histidina es muy pequeña y apenas afecta la función, actividad y estructura de la proteína diana. Agregue 6-10 histidinas al aminoácido.

En condiciones de desnaturalización, debido a que puede unirse fuertemente a la columna quelante de Ni2 +, se eluye con imidazol para lograr la separación y purificación de proteínas.


5 Cromatografía de interacción hidrofóbica

El principio de la cromatografía de interacción hidrofóbica es: bajo alta fuerza iónica, la proteína en el sistema de agua salada se desolva parcialmente y los grupos hidrofóbicos internos quedan expuestos.

Estos residuos pueden tener interacciones hidrófobas reversibles con los grupos funcionales hidrófobos en el medio. Cuando se reduce la concentración de iones, el grupo hidrófobo de la proteína se esconde, el efecto desaparece y se completa la elución.

Debido a las diferentes fuerzas hidrofóbicas entre diferentes proteínas y los ligandos hidrofóbicos en el medio, se puede lograr la separación y purificación de proteínas. El método tiene bajo costo, puede retener la actividad biológica de la proteína y se usa ampliamente.


6 Electroforesis

El principio de la electroforesis para separar y purificar proteínas es que, bajo la acción de un campo eléctrico, las partículas coloidales punteadas se mueven hacia el electrodo con propiedades eléctricas opuestas, y cuanto más grande es la molécula, más lenta es la velocidad de movimiento.

SDS-PAGE se puede utilizar para la separación y purificación de proteínas. La proteína se puede desarrollar mediante agentes colorantes. La ventaja es que es fácil de operar, económico e intuitivo; la desventaja es que no se puede utilizar a gran escala.