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8 condiciones para que los microorganismos expresen proteínas

Tiempo de actualizacion : 2020-09-27

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8 condiciones para que los microorganismos expresen proteínas

La expresión de proteínas en microorganismos es una tecnología fundamental en biotecnología. Es relativamente fácil expresar la proteína en un huésped similar a la fuente de la proteína diana.

Sin embargo, la mayoría de las veces, necesitamos expresar proteína en un huésped diferente de la fuente de la proteína, como expresar proteínas eucariotas en células procariotas, lo que generalmente es un desafío.


Aquí, General Biosystems comparte con usted varias herramientas que ayudan a lograr la expresión de proteínas en todos los sistemas.

1. Optimización de codones
La optimización de codones consiste en introducir codones que el sistema huésped está más dispuesto a leer en el vector que construimos, de modo que pueda traducirse en aminoácidos más fácilmente, lo que aumentará la velocidad de traducción y aumentará la eficiencia de la expresión de proteínas.

2. Etiquetas de purificación

Cuando expresamos proteínas en microorganismos, generalmente terminamos purificando las proteínas. Por supuesto, si solo usa extractos de células enteras o extractos lisados, no necesita considerar la purificación de proteínas.

Para lograr la purificación de proteínas, debemos agregar etiquetas de purificación a la proteína. En la actualidad, se han estudiado y aplicado sistemáticamente en la práctica muchas etiquetas de purificación. Las etiquetas de purificación comúnmente utilizadas incluyen la etiqueta His, la etiqueta Strep-II, GST, Flat-Tag, etc.


3. Chaperonas moleculares y enzimas plegables
Para obtener una proteína útil, es muy importante asegurarse de que la proteína se doble correctamente. Para ayudar a que la proteína se pliegue correctamente y prevenir la formación de cuerpos de inclusión insolubles, necesitamos vectores auxiliares que expresen chaperonas y enzimas de pliegue.

4. Lugar de expresión de proteínas

Antes del experimento, debemos considerar dónde se expresa la proteína, si se secreta en el citoplasma, sustancia intercelular o extracelular.

Si una proteína contiene enlaces disulfuro, será mejor que la expresemos en el entorno oxidativo de la sustancia intercelular.

El entorno oxidante puede ayudar a las proteínas a formar los enlaces disulfuro correctos para obtener la estructura correcta.

Si desea que la proteína se exprese en una ubicación específica en la célula o se secrete fuera de la célula, debe agregar un péptido señal al extremo N de la proteína. Con la ayuda de péptidos señal, las proteínas se pueden transferir a ubicaciones específicas.


5. Vía de expresión de proteínas

La secreción y expresión de proteínas tiene muchas ventajas. Por un lado, la secreción y expresión de proteínas puede reducir la toxicidad y la carga metabólica sobre las bacterias huésped y aumentar la adaptabilidad de las bacterias; por otro lado, el contenido de proteína de la bacteria huésped en el espacio periplásmico y el medio extracelular es muy bajo, lo que favorece la purificación de la proteína diana.

Las diferentes vías de expresión tienen una gran influencia en la eficacia de plegamiento de las proteínas.


6. Tensión de expresión

Las diferentes cepas de Escherichia coli tienen grandes diferencias en las condiciones de cultivo y la capacidad de expresión de genes extraños. Por lo tanto, la selección de diferentes bacterias hospedadoras juega un papel vital en la acumulación de productos de expresión y la separación y purificación posteriores.

El uso de cepas mutantes defectuosas en la expresión de proteasas puede aumentar la secreción y expresión de proteínas recombinantes.

Algunas cepas defectuosas (como los mutantes genéticos que sintetizan elementos de la membrana externa) pueden producir proteínas activas solubles con la estructura espacial correcta y enlaces disulfuro, y pueden evitar el efecto obstaculizador de la pared celular en el transporte transmembrana de proteínas extrañas y facilitar la secreción de proteínas recombinantes en el medio de cultivo.


7. Factores como medio de cultivo, temperatura, condiciones de inducción, etc.

La composición del medio, el método de cultivo, las condiciones de cultivo y la acumulación de metabolitos inhibidores durante el proceso de cultivo afectarán la expresión y secreción de proteína recombinante en bacterias manipuladas. Entre ellos, la composición de nutrientes del medio, el pH y la temperatura son factores importantes que afectan el crecimiento y la expresión de proteínas extrañas de bacterias manipuladas y pueden afectar la actividad, secreción y expresión de proteasa.

La adición de glicina al medio de cultivo puede promover la secreción de proteína desde el espacio periplásmico al extracelular sin causar autólisis de las bacterias y no causa una lisis bacteriana significativa. Agregar goma de azúcar y TritonX-100 al medio puede prevenir la formación de cuerpos de inclusión en la cavidad periférica y mejorar la eficiencia de la expresión extracelular.

Cambiar la presión osmótica del medio, la inducción de choque térmico a corto plazo y bajar la temperatura durante la inducción aumentará significativamente la expresión soluble de la proteína recombinante en E. coli.

Además, para las cepas que requieren inducción de IPTG, se deben optimizar el tiempo de inducción, la temperatura y el tiempo de cultivo.


8. Tiempo de cultivo celular

El tiempo de cultivo celular apropiado es un factor importante que determina la integridad celular y el nivel de expresión de proteínas. Un tiempo de cultivo celular prolongado provocará la lisis celular, la pérdida de la proteína diana y la liberación de proteasas tóxicas.

La consecuencia directa de un tiempo de cultivo celular demasiado corto es que la concentración celular no es suficiente y el rendimiento de la proteína diana es demasiado bajo. Por tanto, se debe optimizar el tiempo de cultivo de las cepas recombinantes.